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單細胞基因組測序 單細胞基因組測序是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組之后進行高通量測序，用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系。全基因組測序的應用范圍涉及臨床醫(yī)藥研究、群體遺傳學研究、關聯分析、進化分析等眾多領域。 1、實驗方案 測序策略：Illumina HiSeq X PE 150 數據量：推薦30~50×測序深度 2、技術優(yōu)勢 （1） 多種變異檢測：單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失（InDel）和結構變異（SV）； （2） 與芯片方法比較，可以檢測到新的變異序列； （3）與人類全基因組從頭測序相比，耗時更短、成本更低。 3、數據分析 3.1 標準信息分析 （1）按標準流程進行數據整理及數據質量評估； （2）與參考基因組比對； （3）SNP的檢測及其在基因組的分布； （4）InDel的檢測及其在基因組的分布； （5）CNV的檢測及其在基因組的分布； （6）包含變異基因的功能注釋（GO注釋、Pathway注釋）。 3.2 高級信息分析（腫瘤基因組學） （1）癌基因/抑癌基因/易感基因篩查； （2）高頻突變基因統(tǒng)計及通路富集分析； （3）NMF突變特征及突變頻率分析； （4）NovoDriver已知驅動基因篩選； （5）基因組變異Circos圖展示。 4、技術流程 5、案例分析 案例（1） 單細胞基因組測序解構正常成人大腦的單個神經元突變 來自霍華德休斯醫(yī)學研究所的（HHMI）的研究人員從三位去世的成人捐贈的健康大腦中分離出了36個神經元并測序了它們的基因組。為了進行比較，科學家們還從每個個體的心臟中分離出了細胞進行DNA測序。他們發(fā)現每個神經元的基因組都是獨特的。每個神經元都有1000多個點突變，只有少數突變出現在一個以上的細胞中。盡管神經元中的大多數突變是獨特的，一小部分出現在了多個細胞中。這表明了這些突變起源于腦細胞仍在分裂之時——這一過程在出生前便完成。這些早期突變隨細胞分裂和遷移傳遞下去，科學家們能夠利用它們來重建部分大腦發(fā)育史。 圖1 腦中體細胞SNV位點與神經系統(tǒng)功能和疾病相關 案例（2） 一種新的單細胞基因組測序方法-組合索引測序 單細...
Exosome lncRNA測序 Exosome作為活細胞分泌的含有RNA和蛋白質的微囊，大小為30-100nm，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。最新研究表明，體液中 exosomal RNA （特別是miRNA、piRNA和lncRNA等非編碼RNA）在不同的疾病模型中存在明顯的表達差異。同時，這些分子被exosomes的脂膜所包裹和保護，能保持其原有穩(wěn)定性和生物學功能，有望成為液體活檢的重要分子標志物。 通過exosome lncRNA測序技術，可以開發(fā)針對復雜疾病的無創(chuàng)早期檢測標志物；指導針對復雜疾病特別是腫瘤的個性化治療；用于疾病的預后判斷，特別是循環(huán)系統(tǒng)疾病和腫瘤。 華銀采用全球領先的exosome RNA富集和提取技術，并結合微量RNA建庫和高通量測序技術，提供exosome lncRNA研究整體解決方案，為廣大的生物醫(yī)學研究者提供最高質量的技術服務。 1、實驗方案 測序策略：Illumina NextSeq 500 或 HiSeq 3000 PE150 數據量：推薦12G clean data 2、技術優(yōu)勢 （1）任意物種檢測：相對傳統(tǒng)芯片而言，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因或基因組信息，能夠直接對任何物種進行最全面的轉錄組分析； （2）分辨率高：可以檢測轉錄本中單堿基的差異； （3）檢測范圍廣：從幾個到數十萬個拷貝精確計數，可同時鑒定正常和稀有的轉錄本； （4）信息分析廣：可以做基因差異表達分析、可變剪切、融合基因分析；新轉錄本預測及注釋。 3、數據分析 3.1 標準信息分析 （1）數據過濾及質量評估 （2）核糖體RNA去除率計算 （3）比對參考基因組及統(tǒng)計 （4）基因表達水平分析 （5）基因表達差異及聚類分析 （6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種） （7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種） （8）已知mRNA表達量分析 （9）已知mRNA差異表達及聚類分析 （10）已知lncRNA表達量分析 （11）已知lncRNA差異表達及聚類分析 （12）預測新lncRNA （13）新lncRNA鑒定和表達量分析 （14）新lncRNA差異表達及聚類分析 （15）新lncRNA家族分析 （16）SNP和Indel檢測與注釋 （17）生物學重復樣品間相關性分析 （18）蛋白互作網絡分析 （19）基因融合 （20）主成份...
Exosome miRNA測序 Exosome是由活細胞分泌的含有 RNA 和蛋白質的微囊，大小為30-100nm。幾乎所有類型的細胞都能分泌，廣泛存在于各種體液中，包括血清、尿液、細胞培養(yǎng)上清、乳汁、唾液、腹水、羊水、氣管肺泡灌洗液和關節(jié)滑液等。Exosome參與調控重要的細胞生理活動，在免疫應答、凋亡、血管生成、炎癥反應、凝結過程中的作用均有報道，可以成為多種疾病的早期診斷標記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療。 Small RNA是一類高度保守的小RNA分子，它可以參與基因表達與調控、RNA的加工與剪切、蛋白質翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等重要生物學過程，是生命活動中必不可少的調控因子。小RNA測序技術采用膠分離技術，收集樣本中18~30nt的RNA片段，利用高通量測序技術對樣本中所有small RNA家族進行測序和表達定量，從而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等序列，并預測新的小RNA及其靶基因。 1、實驗方案 測序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 數據量： 推薦10M clean reads 2、技術優(yōu)勢 通量高：一次測序得到上千萬條序列； 分辨率高：可以檢測小RNA單個堿基的差異； 精準度高：從幾個到幾十萬個拷貝精確計數； 可重復性好：深度測序保證了抽樣隨機性，重復性好，無需重復實驗； 檢測范圍廣：既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現新的小RNA。 3、數據分析 3.1 標準信息分析 （1）按標準流程進行數據整理及數據質量評估； （2）樣品間的公共序列和特異序列分析； （3）小RNA與參考基因組比對分析； （4）按照優(yōu)先級將小RNA進行分類注釋 （5）Novel Small RNA預測； （6）樣本間miRNA差異表達分析； （7）已知miRNA的家族分析； （8）已知miRNA差異分析（≥2個樣本）和聚類分析（≥3個樣本）； （9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預測； （10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析； （11）novel miRNA差異分析（≥2個樣本）和聚類分析（≥3個樣本）； （12）差異miRNA靶基因預測； （13）已知miRNA的堿基編輯分析； 3.2 高級信息分析 （1）snoRNA注釋 （2）piRNA注釋 （3）mir2disease注釋 4、技術流程 5...
LncRNA測序 長鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長度在200nt以上且不編碼蛋白質的RNA，以帶polyA尾和不帶polyA尾兩種形式廣泛存在于各種生物體內，參與細胞內多種過程調控，具有跨物種的低保守性，組織特異性表達和豐度低等特點。 近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾和核內運輸等多種重要的調控過程，但絕大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。應用高通量測序技術，研究人員能夠快速獲得與疾病或者特定生物學過程相關的lncRNA 并進行深入研究。 1、實驗方案 測序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 數據量：推薦12G clean data 2、技術優(yōu)勢 （1）任意物種檢測：相對傳統(tǒng)芯片而言，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因或基因組信息，能夠直接對任何物種進行最全面的轉錄組分析； （2）分辨率高：可以檢測轉錄本中單堿基的差異； （3）檢測范圍廣：從幾個到數十萬個拷貝精確計數，可同時鑒定正常和稀有的轉錄本； （4）信息分析廣：可以做基因差異表達分析、可變剪切、融合基因分析；新轉錄本預測及注釋。 3、 數據分析 3.1 標準信息分析 （1）數據過濾及質量評估 （2）核糖體RNA去除率計算 （3）比對參考基因組及統(tǒng)計 （4）基因表達水平分析 （5）基因表達差異及聚類分析 （6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種） （7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種） （8）已知mRNA表達量分析 （9）已知mRNA差異表達及聚類分析 （10）已知lncRNA表達量分析 （11）已知lncRNA差異表達及聚類分析 （12）預測新lncRNA （13）新lncRNA鑒定和表達量分析 （14）新lncRNA差異表達及聚類分析 （15）新lncRNA家族分析 （16）SNP和InDel檢測與注釋 （17）生物學重復樣品間相關性分析 （18）蛋白互作網絡分析 （19）基因融合 （20）主成份分析（PCA） （21）特征性差異表達基因分析 （22）lncRNA保守性分析 （23）可變剪切 3.2 高級分析 （1）已知mRNA-lncRNA共表達網絡構建 （2）基因結構優(yōu)化及優(yōu)化基因的表達值計算 （3）eQTL分析 4、技...
轉錄組測序 轉錄組測序是利用第二代高通量測序技術快速獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉錄本的序列信息，進行疾病與正常樣本間的基因表達差異分析、可變剪切和融合基因分析，尋找與癌癥、遺傳病相關的致病基因，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領域。相對于傳統(tǒng)芯片而言，無需預先設計特異性探針，具有分辨率高、檢測范圍廣和準確率高的優(yōu)點。 1、實驗方案 測序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 數據量：推薦8G clean data，細菌和真菌視轉錄組大小情況而定 2、技術優(yōu)勢 （1）任意物種檢測：相對于傳統(tǒng)芯片而言，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因或基因組信息，能夠直接對任何物種進行最全面的轉錄組分析； （2）分辨率高：可以檢測基因家族中相似基因及可變剪接造成的單堿基差異； （3）檢測范圍廣：從幾個到數十萬個拷貝精確計數，可同時鑒定正常和稀有的轉錄本； （4）信息分析全面：可以做基因差異表達分析、可變剪切、融合基因分析、新轉錄本預測及注釋。 3、信息分析 3.1 標準信息分析 （1）按標準流程進行數據整理及數據質量評估； （2）與參考序列比對，計算不同基因的RPKM值； （3）基因的差異表達分析； （4）樣本間基因表達水平的相關性分析（僅限于有生物重復的樣本）； （5）樣本間差異基因韋恩圖及PCA分析； （6）差異基因的表達模式聚類分析； （7）差異表達基因GO功能富集分析； （8）差異表達基因Pathway顯著富集分析； （9）差異表達基因的蛋白質互作網絡分析； （10）條件特異表達； （11）鑒定基因的可變剪切； （12）SNP/InDel分析； （13）新轉錄本預測及注釋； （14）融合基因分析（僅限于人）； 3.2 高級信息分析： （1）基因結構優(yōu)化（只針對真核生物） （2）RNA編輯 （3）差異基因的轉錄因子分析（適用于植物） 4、技術流程 5、案例分析 案例（1）科學家繪制細胞周期的高分辨率轉錄組圖譜 細胞周期的推進很大程度上依賴于周期性基因表達。本研究繪制了細胞周期的高分辨率轉錄組圖譜，揭示了周期性基因與癌癥之間的新關聯。研究人員在兩個連續(xù)的細胞周期中對人類細胞進行RNA測序...
外顯子組測序 外顯子組測序是指利用高效的序列捕獲技術將基因組中的外顯子區(qū)域捕獲后進行高通量測序的方法。在人類基因中大約有180,000個外顯子，雖然外顯子組僅占人類基因組的1%（約30MB），但是約85%的致病突變發(fā)生在外顯子組區(qū)域。外顯子組測序主要用于識別和研究與疾病、種群進化相關的編碼區(qū)及UTR區(qū)域內的結構變異。結合大量的公共數據庫提供的外顯子數據，能夠更好地解釋所得變異結構之間的關聯和致病機理。相比傳統(tǒng)方法，外顯子組測序能夠更經濟高效的檢測外顯子區(qū)域的變異情況，以此來為臨床診斷和個體化用藥服務。外顯子組測序目前已被廣泛的應用于各種癌癥、單基因病、復雜疾病和罕見遺傳病等研究中。 1、實驗方案 捕獲平臺：Agilent SureSelect Human All Exon V6（最新捕獲試劑盒） 測序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 數據量：推薦100×以上的深度測序，約10G clean data 2、技術優(yōu)勢 （1）高覆蓋度：同等費用下獲得更高深度測序，SNP檢出率99%； （2）更高通量：適合大樣本量的研究； （3）經濟高效：相比于全基因組重測序，更加經濟、高效； （4）周期短：加快文章發(fā)表與加速臨床應用。 3、數據分析 3.1 標準信息分析 （1）按標準流程進行數據整理及數據質量評估； （2）與參考序列進行比對、統(tǒng)計測序深度及覆蓋度； （3）SNP和InDel變異信息檢測； （4）SNP和InDel變異所在基因的功能注釋（GO、Pathway）； （5）CNV檢測和注釋分析； （6）變異基因保守性預測及致病性分析（SIFT、Polyphen-2、GERP）； 3.2 高級信息分析 （1）癌基因/抑癌基因/易感基因篩查； （2）高頻突變基因統(tǒng)計及通路富集分析； （3）NMF突變特征及突變頻率分析； （4）已知驅動基因篩選； （5）基因組變異Circos圖展示。 4、捕獲平臺介紹 Agilent SureSelect Human All Exon V5 特點如下： （1） 捕獲范圍為50Mb，包括21,522條基因的357,999個外顯子區(qū)域； （2） 根據CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGA及UCSC數據庫設計探針，可有效獲得外顯子區(qū)及其周邊區(qū)域的變異信息。 （3）周期短，僅需1.5天，測序樣品便可準備就緒。 5、技術流程 6、案例分析 ...
全基因組重測序 目前人類已知的疾病中，有4000多種疾病與人類的基因有關。利用全基因組重測序的方法，可以在全基因組水平上檢測與疾病相關的突變位點、結構變異等信息，進而找尋攻克這些疾病的治療手段，研發(fā)有效地治療藥物。全基因組測序的應用范圍涉及臨床醫(yī)藥研究、群體遺傳學研究、關聯分析、進化分析等眾多領域。 1、實驗方案 測序策略： illumina HiSeq X PE150 數據量：推薦腫瘤50×測序深度/對照癌旁、血液30×測序深度；遺傳病30~50×測序深度。 2、技術優(yōu)勢 （1）多種變異檢測：單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失（InDel）和結構變異（SV）； （2）與芯片方法相比，可以檢測到新的變異序列； （3）與人類全基因組從頭測序相比，耗時更短、成本更低。 3、數據分析 3.1 標準信息分析 （1）按標準流程進行數據整理及數據質量評估； （2）與參考基因組比對； （3）SNP的檢測及其在基因組的分布； （4）InDel的檢測及其在基因組的分布； （5）CNV的檢測及其在基因組的分布； （6）包含變異基因的功能注釋（GO注釋、Pathway注釋）。 3.2 高級信息分析（腫瘤基因組學） （1）癌基因/抑癌基因/易感基因篩查； （2）高頻突變基因統(tǒng)計及通路富集分析； （3）NMF突變特征及突變頻率分析； （4）已知驅動基因篩選； （5）基因組變異Circos圖展示。 4、技術流程 5、案例分析 案例（1）胰腺神經內分泌腫瘤的全基因組圖譜 胰腺神經內分泌腫瘤（PanNETs）是第二大胰腺上皮細胞腫瘤，致死率達60%。隨著檢測手段越來越靈敏，胰腺神經內分泌腫瘤診斷數量呈現上升趨勢，這給臨床診療帶來了一定的挑戰(zhàn)！在一項新的研究中，研究人員揭示出正常情形下與乳腺癌、卵巢癌和結腸癌相關聯的基因變異同樣能夠促進一種罕見的胰腺癌產生。EWSR1與BEND2發(fā)生體細胞融合，確定BEND2為EWSR1的一個新融合基因。發(fā)生體細胞融合的患者，其細胞形態(tài)和免疫組化特征具有典型的胰腺神經內分泌腫瘤特征。通過RNA-seq和RT–PCR確認了EWSR1和FLI1發(fā)生體細胞融合。 圖1 胰腺神經內分泌腫瘤中的突變特征 案例（2）全基因組測序確定EN1作為骨密度和骨折的決定因素 本研...
細菌基因組測序/小基因組測序(10K~1M的DNA序列) 隨著新一代測序技術的迅猛發(fā)展，全基因組測序已經成為細菌基因組研究不可或缺的重要工具。新一代高通量測序技術大大降低了細菌基因組研究成本，縮短了研究周期，為實驗室的細菌基因組研究提供了便利。 細菌不但個體微小，其基因組也比動植物小得多，一般在10M以內。微生物基因組測序能夠檢測微生物全基因組的核苷酸變異，通過全基因組測序，研究人員可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)、拷貝數變異(CNV)、插入缺失(InDel)、結構變異(SV)等變異信息，應用范圍涉及臨床醫(yī)藥研究、微生物致病性研究、物種進化分析等領域。 1、實驗方案 測序策略：Illumina MiSeq PE250/PE300 數據量：推薦測100×以上 2、數據分析 2.1 標準信息分析 （1）按標準流程進行數據整理及數據質量評估 （2）K-mer分析以及基因組大小估計 （3）序列組裝 （4）組裝基因組的深度和覆蓋度分析 （5）組裝結果的核酸庫比對分析 （6）基因預測 （7）基因功能注釋(GO-COG/KOG) （8）基因生物通路注釋(KEGG) 2.2 高級信息分析 （1）基因組詳細信息環(huán)形圖 （2）共線性分析 （3）基因家族分析 （4）CRISPR預測 （5）基因島預測（毒力島） （6）前噬菌體預測 （7）分泌蛋白預測 （8）動植物病原菌致病性分析等 3、技術流程 4、案例分析 案例（1）高通量測序分析發(fā)現新細菌 德國微生物學與細胞培養(yǎng)研究所微生物系最近從咸水環(huán)境微生物墊的低氧過渡區(qū)中分離培養(yǎng)獲得了一種中度嗜鹽，專性厭氧，分解糖類的細菌，并編碼代號為L12-Fru-ABT。利用16s測序分析后發(fā)現該微生物應該代表著一個新的種屬，研究發(fā)現該菌在各種缺/微氧環(huán)境中都廣泛存在，比如咸水環(huán)境，沸水和動物腸道；隨后，研究人員利用全基因組測序方法對該菌進行基因組序列分析，結合該菌的表型，推斷出L12-Fru-ABT該菌及其相關細菌是能夠專門適應和利用微生物墊或生物膜產生的硫酸化的甘油聚合物。 圖1 基于16s rRNA基因測序的L21-Fru-ABT在發(fā)育樹的位置圖 圖2 K.glycovorans L21-Fru-ABT和幾個PVC superphylum的代表性細菌的基因組系統(tǒng)發(fā)育構成成分 案例...
免疫組庫測序（華銀特色服務項目） 免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指某個個體在任何特定時間點其循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B淋巴細胞和T淋巴細胞的總和。T細胞和B細胞分別介導機體的細胞免疫和體液免疫應答，分別通過其表面的T細胞受體（TCR）和 B細胞受體（BCR）來識別和結合抗原，進而發(fā)揮功能清除病原體或體內腫瘤細胞。 免疫組庫高通量測序是通過多重PCR或SMART RACE法擴增TCR/BCR全長或CDR3區(qū)序列（主要是TCR的β鏈或BCR的重鏈），再結合高通量測序技術，對機體免疫組庫的多樣性及每種 T、B細胞克隆的獨特性序列組成和變化進行分析，從而全面評估機體的免疫狀態(tài)，明確疾病與T、B細胞克隆組成及變化之間的關系。隨著免疫組庫高通量測序技術的不斷發(fā)展和成熟，基于免疫組庫多樣性變化特點的生物標志物發(fā)現、腫瘤等疾病療效預測、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要進展。 1、實驗方案 測序平臺： Illumina MiSeq PE300 或 NextSeq 500 PE150 2、樣本要求 （1）分選的T或B細胞：建議細胞數103-107個，離心后保存于1ml Trizol中并混勻，低溫保存運輸。 （2）外周血單個核細胞（PBMC）：建議細胞數103~107個，離心后保存于1ml Trizol中并混勻，低溫保存運輸。 （3）新鮮全血：采集外周血于EDTA抗凝管內，混勻后取 250μl，保存于750μl Trizol LS并混勻，低溫保存運輸。 （4）組織：取50~100mg組織，保存于1ml Trizol中，低溫保存運輸。 （5） 如果客戶自提 RNA，建議最好用進口試劑或試劑盒提取，最后溶于無RNA酶的水中。如果是分離的PBMC，RNA濃度大于50ng/μL，總量大于500ng。如果用組織提 RNA，濃度＞500ng/μL，總量＞5μg。 3、技術優(yōu)勢 （1）用免疫組庫擴增最可靠的SMART RACE法，保證結果的可靠性和后期研究的方便性； （2）用最優(yōu)選最可靠的擴增和建庫試劑，保證組庫序列擴增的保真性和擴增效率； （3）由武漢大學、中山大學、南方醫(yī)科大學以及美國斯坦福大學研究人員組成的專業(yè)的研究和分析團隊，保證研究結果的可信度和可重復性； （4）針對不同樣品類型（細胞、組織、全血），不同濃度梯度細胞數（100個以上淋巴細胞）均可建庫測序； （5）運用國際認可的專業(yè)的免疫組庫分析模塊，并結合我們自己獨有的生物信息分析算法，所提供的標準...
