16S+代謝組學聯(lián)用常見問題一攬子告訴你答案
2023-01-12 閱讀數:5526
微生物16S分析鑒定了樣本中微生物的種類和可能具有的功能,但是微生物真的有這樣的功能嗎?怎么能快速準確地做出鑒定呢?那就來試試16S+代謝組學聯(lián)用的方法吧。
組學聯(lián)用,一個鑒定微生物種類,一個鑒定微生物功能,還能發(fā)高分文章,why not?
1、16S是什么?
16S rDNA是指細菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對應的DNA序列,序列全長約1540bp,包含10個保守區(qū)和9個高變區(qū)(V1-V9)。保守區(qū)序列在細菌間差異不大而高變區(qū)則具有種屬特異性,因此最常用作細菌分類標準。通過對環(huán)境樣品的細菌總DNA進行提取,擴增其中16S rDNA基因,可以鑒定出絕大多數細菌類別。
2、代謝組學是什么?
代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發(fā)展起來的新興的組學技術,是系統(tǒng)生物學的組成部分。其對生物體內所有小分子代謝物進行定性定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式,其研究對象大都是分子量1500以內的小分子物質。
3、為什么要選擇做16S+代謝組學?
16S只是研究了腸道微生物的構成和組份的改變與宿主的生理以及人類的疾病相關。然而,腸道微生物對宿主的作用其中一方面貢獻是通過腸道中微生物產生的小分子次級代謝產物,通過循環(huán)系統(tǒng)來作用于人體的各個部位,調控宿主體內的穩(wěn)態(tài),比如許多研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物的代謝產物對糖尿病、高血壓、心臟病和抑郁、腸道的免疫等疾病都有影響。16S可以得到樣本當中有哪些微生物,和預測他們的功能,而代謝組學研究代謝物的表達量、代謝物與生理病理變化的關系,能夠幫助確定這些功能是否真的發(fā)生了,發(fā)生的程度是什么樣的。兩者的聯(lián)用,可以通過代謝組結果的檢測輔助和驗證16S分析結果;兩者的聯(lián)合分析可以得到微生物多樣性、種類、相對豐度與代謝物豐度的關聯(lián)。
4、代謝組學與其他組學相比,有什么優(yōu)勢?
①基因和蛋白質表達的微小變化會在代謝物水平得到放大;
②代謝組學的研究不需進行全基因組測序及建立大量表達序列標簽的數據庫;
③代謝物種類遠少于基因和蛋白的數目,每個生物體中代謝產物大約在103數量級,而最小的細菌,其基因組中也有幾千個基因;
④生物體液的代謝物分析可反映機體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。
5、與16S聯(lián)用時,如何選擇是用非靶標代謝組還是高通量靶標代謝組?
如果沒有特別關注的代謝物質建議選擇非靶標,可以檢測出某一特定條件下所有的代謝產物,并進行定性和相對定量分析,以尋找目標差異代謝物;如果有關注的目標代謝物建議選擇高通量靶標代謝組,對特定的代謝物群進行有針對性的特異性檢測。
6、16S 與代謝組聯(lián)用時,一般檢測哪些樣品類型?樣本量需要多少?
代謝組與16S聯(lián)用時,16S的樣品主要是糞便和腸道內容物;而代謝組的樣本主要是糞便、血漿或血清、尿液等(具體項目可以參考相應的參考文獻)。
臨床標本:每組100例(不少于30例,越多越好)
模式動物:每組12個樣品(不少于8個,越多越好)
注意:遵從“保持最鮮活的狀態(tài)”原則,通過低溫、淬滅的方法阻止離體后的代謝活動。樣品不能pooling,不能反復凍融;血清/血漿不能溶血;如果是用血漿,請用肝素鈉抗凝,EDTA抗凝效果不好。
7、代謝組為什么需要這么多生物學重復?
相較于基因和蛋白,代謝物處于生命活動的下游,動態(tài)波動性大。因此需要很多生物學重復來增加數據的可靠性和說服力。
8、代謝組和16S的樣品取樣時間可以不一致?
建議取樣時間一致。
若代謝組和16S樣本類型一樣,那么在收集樣品的時候可以多準備一份樣品,即一個樣分裝至少2兩管,一管用于16S,一管用于代謝組。
若代謝組和16S樣本類型不一樣,也應該要保持一樣的取樣時間。
9、同一樣本的代謝組為什么不能分兩批檢測?
最好不要分成兩批檢測,因為這兩個時間點儀器的響應會發(fā)生變化,這樣可能導致的問題是一些含量低的物質可能只在一個批次里被檢出。
10、代謝組學我該選擇哪個平臺?
代謝組學的技術平臺主要分為NMR(核磁共振譜)、GC-MS(氣相色譜-質譜聯(lián)用)、LC-MS(液相色譜-質譜聯(lián)用)。
NMR的特點是樣品需求量小,前處理比較簡單,對于復雜的生物樣本比較合適;但對讀譜人員的要求高;靈敏度低,檢測動態(tài)范圍有限。
GC-MS和LC-MS的特點是結合了色譜良好的分離能力和質譜的普適性、高靈敏度以及專一性,具體而言GC-MS分辨率、選擇性好,數據庫較為健全,但樣品處理過程繁瑣;LC-MS靈敏度、分辨率高,可以分析不穩(wěn)定、不易衍生化、難揮發(fā)和分子量大的代謝物,可對極性化合物有較好的檢測。但數據庫不健全,可鑒定的化合物有限。
因此在選擇平臺時應結合自身樣本情況與個體需求,綜合考慮。
11、色譜質譜串聯(lián)的優(yōu)勢是什么?
使用靈敏度更高、分辨率更高、定性能力更強的質譜儀代替了光學檢測器。將色譜的分離能力和質譜的分辨、定性能力強強聯(lián)合,可以對更多的物質進行準確檢測。
12、與16S聯(lián)用時,代謝組檢測平臺一般選擇GC-MS,還是LC-MS?
兩種平臺都可以,因為檢測平臺是依據檢測的代謝物類型來推薦的,具體參考如下圖:
13、能區(qū)分哪一個是寄主的代謝產物,哪個是哪種微生物的代謝產物嗎?
通過腸道菌群非靶向代謝組學的自建數據庫,篩選出代謝物是微生物特有的,哪些是共有的,哪些是宿主的。
注:1166個腸道菌群特有的代謝物(其中884個有MS2譜圖),868個人菌共有的代謝物,366個人特有的代謝物,合計共2400個。
14、做了代謝組學發(fā)現(xiàn)沒有差異,該怎么辦?
如果沒有找到差異代謝物,那么還可以就檢測到的物質進行KEGG Patheway分析,即對代謝物參與的代謝通路進行研究,觀察是否有其他的補給途徑、代謝途徑與疾病之間是否存在一定的關聯(lián)性。
15、代謝組檢測結果的物質名稱都是英文的,我需要中文名稱怎么辦?
建議根據物質的KEGG名稱和CAS號在“愛化學”(http://www.ichemistry.cn/)網站查詢中文名稱。
16、如何對差異代謝物做進一步的篩選?
一般是使用 P值<0.05 & VIP>1這樣的卡值來進行差異物的篩選。
P值來源單元變量統(tǒng)計分析,VIP值來源于多元變量統(tǒng)計分析(來源于 OPLS-DA模型)表征該變量對兩組差異的貢獻值,當然VIP值越大對差異貢獻越大。
使用P值<0.05 & (FC>2或FC<0.5) [FC= Fold change]來進行差異物篩選也是有這樣的做法,但是P值和FC值都來源單元變量統(tǒng)計分析。推薦使用P值<0.05 & VIP>1的篩選方法。
在此基礎上要做進一步的篩選的話,有以下幾個方法:
1)P 值<0.05,對VIP值做排序(VIP值越大,差異代謝物越有意義)
2)VIP>1,對 P值做排序(P值越小,差異代謝物越有意義)
3)在 P 值<0.05 & VIP>1 的范圍內,對FC值做排序(大于2的FC,越大越有意義;小于0.5的FC,越小越有意義)
限定更嚴格的基礎篩選條件,比如:P值<0.01 & VIP>2。重做以上三種方法。
高通量測序檢測中心
中心定位于科研服務與臨床醫(yī)學轉化應用,圍繞基礎科研和臨床檢測兩大板塊,致力于生物醫(yī)學各領域的相關研究與測序大數據聯(lián)合分析,為各大高校、醫(yī)院和科研單位提供醫(yī)學科研項目的方案設計、測序實驗和數據分析為一體的一站式服務以及快速精準的臨床檢測服務,以成為業(yè)內領先的高通量測序服務中心為目標。
目前,我司高通量測序檢測中心擁有Illumina和MGI等高通量測序儀組成的大規(guī)模高通量測序服務平臺,科研服務可提供涵蓋基因組學、轉錄組學(外泌體)、表觀組學、單細胞組學、微生物組學、免疫組庫、代謝組學、蛋白組學和多組學關聯(lián)分析等組學基礎研究服務和高級生物信息分析;臨床服務包括遺傳性腎病基因檢測、血液腫瘤基因檢測、實體瘤基因檢測、感染性疾病病原體檢測等服務。
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