華銀康單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目送樣指導(dǎo) | 單細(xì)胞篇
2023-05-11 閱讀數(shù)：3744
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)能實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲，能夠一次性分離、并標(biāo)記500–10000個(gè)單細(xì)胞，從而獲得每個(gè)細(xì)胞的3’端的轉(zhuǎn)錄組信息。具有細(xì)胞通量高、建庫成本低、捕獲周期短等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)主要用于細(xì)胞分型和標(biāo)記因子的鑒定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測(cè)，此外該技術(shù)還可以預(yù)測(cè)細(xì)胞分化與研究發(fā)育軌跡，在當(dāng)下疾病、免疫、腫瘤領(lǐng)域以及組織、器官、發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用。迄今為止，研究的樣本類型已有來自腫瘤，干細(xì)胞，胚胎，神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)不同部位，理論上真核生物都能進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在樣本選擇好之后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否理想，很大程度取決于樣本的質(zhì)量，下面是樣本準(zhǔn)備以及推薦樣本量的介紹，供廣大科研工作者參考。
樣本類型以及處理運(yùn)輸
1.組織樣本
1.1新鮮組織樣本
（新鮮組織包含實(shí)體腫瘤組織及其他病理組織），目前組織成功解離經(jīng)驗(yàn)包含組織如下：
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人 |
小鼠 |
大鼠 |
豬 |
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外周血 腎臟 肝臟 皮膚 肺 黃韌帶 乳腺（癌） 胰腺（癌） 骨髓 氣道組織 動(dòng)脈瓣膜 結(jié)直腸（癌） 闌尾 胃黏膜 胃（癌）-原位和轉(zhuǎn)移灶 |
腦
腎臟
食道癌皮下組織
胰腺
肝臟
睪丸
坐骨神經(jīng)
視網(wǎng)膜
股骨
脛骨 |
股骨 脛骨 坐骨神經(jīng) 腎臟 肝臟
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卵巢
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（以上表格中組織可直接聯(lián)系實(shí)驗(yàn)員送樣，不在上表中的其他送樣組織，如果不了解組織特性，請(qǐng)咨詢相關(guān)人員）
組織樣本要求：大于0.2g實(shí)體瘤組織，保護(hù)液能完全浸沒組織為宜，如樣本量足夠建議首次寄送時(shí)同一樣本2~3管重復(fù)。收到組織保存液后，及時(shí)使用，以免過保：將適量樣本用無菌生理鹽水清洗干凈血漬后，放入裝有組織保存液的儲(chǔ)存管中，迅速蓋緊加封口膜包裝好；無菌操作：操作過程遵循無菌操作，樣本污染可能會(huì)對(duì)后續(xù)數(shù)據(jù)質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，一定注意無菌操作。
樣品包裝：樣本運(yùn)輸環(huán)境為 2-8℃，可冰袋寄送（注意不要選擇干冰），裝有樣本的儲(chǔ)存管不能和冰袋直接接觸，需用泡沫填充或包裹間隔，只有碎冰和冰水混合物樣本管可以接觸。
樣本寄送：樣本保存液對(duì)新鮮樣本的保存時(shí)間為 2-8℃，48小時(shí)，務(wù)必保證在48小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。如銷售協(xié)助樣本運(yùn)輸，可將樣本管插入碎冰運(yùn)輸，請(qǐng)盡量保證樣本在當(dāng)天下午3: 00前送達(dá)，當(dāng)天解離細(xì)胞并開展實(shí)驗(yàn)；當(dāng)天未能送達(dá)的，次日解離細(xì)胞并開展實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)盡量保證樣本在工作日送達(dá)；如不能保證樣本在48小時(shí)內(nèi)送達(dá)的，請(qǐng)銷售和客戶、實(shí)驗(yàn)人員商議，滿足現(xiàn)場(chǎng)解離條件的，可協(xié)調(diào)現(xiàn)場(chǎng)解離上機(jī)或凍存。
1.2冰凍組織樣本
凍存樣本寄送建議:
（1） 樣本凍存：建議組織剪成1~2mm3，0.2~0.5g/管為宜；將取下的樣本直接放入液氮速凍，不需要清洗，然后-80℃保存；
（2） 樣本寄送：如樣本量足夠建議首次寄送時(shí)同一樣本2~3管重復(fù)，以防萬一；樣品做好標(biāo)記，隨樣本寄送《單細(xì)胞送樣信息表》，建議干冰用量15~20公斤（夏季可以適度增加）。
細(xì)胞樣本
2.1貼壁細(xì)胞
樣本要求：從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長(zhǎng)狀態(tài)良好且無污染；倒棄培養(yǎng)基，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入適量預(yù)冷的PBS，洗2次；棄盡PBS，加入適量相應(yīng)的消化酶進(jìn)行消化，利用完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)；細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照 1×106個(gè)細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞500g，4℃離心5min，棄掉上清。樣本保存與梯度凍存：
（1）組織保存液保存（適用于短時(shí)間運(yùn)輸）：每管細(xì)胞用1 mL組織保存液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，封口膜封口；
（2）梯度凍存（適用于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸）：每管細(xì)胞用1mL預(yù)冷細(xì)胞凍存液（高糖DMEM牛血清：DMSO=7: 2: 1） 重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管內(nèi)，封口膜封口；將裝有細(xì)胞的凍存管放入裝有異丙醇的梯度凍存盒中，再將凍存盒放入-80℃冰箱凍存凝固。（凍存盒的凍存速度接近每分鐘1℃，這樣計(jì)算的話，從25℃降到-80℃，要2小時(shí)凍存完成）
沒有梯度凍存盒的話，在冰箱里梯度降溫：先4℃ 10min，后-20℃ 30min，最后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱內(nèi)過夜，過夜后，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中保存；
（3）為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣本備份1-2份，1×106個(gè)/份，以防備部分樣品降解重新取材，制備或送樣，耽誤時(shí)間。樣本量：3×104到1×106個(gè)活細(xì)胞（細(xì)胞活性大于80%）。（4）運(yùn)輸方式：使用組織保存液保存的細(xì)胞樣本，冰袋或碎冰運(yùn)輸，建議取樣后24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；使用梯度凍存的細(xì)胞樣本，將凍存管置于密封好的塑料袋中，并在泡沫盒中裝入足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸
注：凍存會(huì)影響細(xì)胞活性和實(shí)驗(yàn)成功率；建議取樣后盡快送樣，非必要不進(jìn)行凍存，以保證細(xì)胞活性。
2.2懸浮細(xì)胞
樣本要求：確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且無污染；細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照 1×106個(gè)細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞500g，4℃離心5min，棄掉上清；加入500μL預(yù)冷PBS洗滌，500g，4℃離心5min，棄掉上清；
樣本保存與梯度凍存：
（1）組織保存液保存（適用于短時(shí)間運(yùn)輸）：每管細(xì)胞用1mL組織保存液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，封口膜封口；
（2）梯度凍存（適用于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸）：每管細(xì)胞用1mL預(yù)冷細(xì)胞凍存液（高糖DMEM牛血清：DMSO=7: 2: 1） 重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管內(nèi)，封口膜封口；將裝有細(xì)胞的凍存管放入裝有異丙醇的梯度凍存盒中，再將凍存盒放入-80℃冰箱凍存凝固。（凍存盒的凍存速度接近每分鐘1℃，這樣計(jì)算的話，從25 ℃降到-80℃，要2小時(shí)凍存完成）。
沒有梯度凍存盒的話，在冰箱里梯度降溫：先4℃ 10min，后-20℃ 30min，最后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱內(nèi)過夜，過夜后，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中保存；
（3）為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣本備份1-2份，1×106個(gè)/份，以防備部分樣品降解重新取材，制備或送樣，耽誤時(shí)間。樣本量：3×104到1×106個(gè)活細(xì)胞（細(xì)胞活性大于80%）
（4）運(yùn)輸方式：使用組織保存液保存的細(xì)胞樣本，冰袋或碎冰運(yùn)輸，建議取樣后24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；使用梯度凍存的細(xì)胞樣本，將凍存管置于密封好的塑料袋中，并在泡沫盒中裝入足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸。
樣本類型以及處理運(yùn)輸
血液樣本對(duì)樣本實(shí)效性要求最高，需要在采集樣品后數(shù)小時(shí)內(nèi)完成樣本的細(xì)胞分離和處理，主要分離和富集PBMCs，并可能涉及單細(xì)胞多個(gè)組學(xué)產(chǎn)品的聯(lián)合應(yīng)用（如轉(zhuǎn)錄組、細(xì)胞表面蛋白Panel、TCR/BCR 等）；血液樣本的制備需要提前和客戶確定好方案，詢產(chǎn)品經(jīng)理和實(shí)驗(yàn)人員確定好采血量、分離方案、篩選方案等，再行樣品準(zhǔn)備。
血液樣本寄送建議：
（1） 客戶確定方案后，確定采血量，用抗凝管進(jìn)行采樣，建議使用枸緣酸鈉的抗凝管（金黃色蓋，最優(yōu)）或EDTA抗凝管（紫色蓋）采集血樣，采樣后輕輕顛倒管身數(shù)次，室溫平放 5 分鐘，期間可輕搖管身，避免劇烈搖晃造成凝血；室溫2小時(shí)內(nèi)送達(dá)或加等體積常溫1xPBS，輕輕混勻，室溫2小時(shí)內(nèi)送達(dá)；
（2） 如需要進(jìn)行細(xì)胞分選、分離粒細(xì)胞、或從其他組織內(nèi)（如肝臟、脾臟、骨髓等）分離單核細(xì)胞，或需要開展多個(gè)組學(xué)的研究，需提前溝通，確定實(shí)驗(yàn)方案、特殊試劑貨期（如Panel 抗體），再行安排樣品采集；
（3） 血液樣本采樣前，需要提前至少一天和實(shí)驗(yàn)人員預(yù)約；
（4） 采血量建議：?jiǎn)我唤M學(xué)建議每個(gè)樣本采血2-3mL（有條件可多采一份備份使用），可獲得百萬級(jí)的PBMCs；如果涉及2個(gè)以上組學(xué)或需要多樣本SMK標(biāo)記的，建議5mL以上；如果涉及細(xì)胞分選，需根據(jù)標(biāo)的細(xì)胞占比和數(shù)量確定采血量或咨詢相關(guān)人員；需要檢測(cè)組織內(nèi)免疫細(xì)胞的可根據(jù)組織內(nèi)免疫細(xì)胞文獻(xiàn)數(shù)據(jù)適當(dāng)提高解離組織用量。
高通量測(cè)序檢測(cè)中心
中心定位于科研服務(wù)與臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用，圍繞基礎(chǔ)科研和臨床檢測(cè)兩大板塊，致力于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的相關(guān)研究與測(cè)序大數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，為各大高校、醫(yī)院和科研單位提供醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目的方案設(shè)計(jì)、測(cè)序?qū)嶒?yàn)和數(shù)據(jù)分析為一體的一站式服務(wù)以及快速精準(zhǔn)的臨床檢測(cè)服務(wù)，以成為業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的高通量測(cè)序服務(wù)中心為目標(biāo)。
目前，我司高通量測(cè)序檢測(cè)中心擁有Illumina和MGI等高通量測(cè)序儀組成的大規(guī)模高通量測(cè)序服務(wù)平臺(tái)，科研服務(wù)可提供涵蓋基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（外泌體）、表觀組學(xué)、單細(xì)胞組學(xué)、微生物組學(xué)、免疫組庫、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析等組學(xué)基礎(chǔ)研究服務(wù)和高級(jí)生物信息分析；臨床服務(wù)包括遺傳性腎病基因檢測(cè)、血液腫瘤基因檢測(cè)、實(shí)體瘤基因檢測(cè)、感染性疾病病原體檢測(cè)等服務(wù)。
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