傳統(tǒng)的高通量測序是對(duì)某一組織整體的細(xì)胞合集進(jìn)行測序和分析，而某一個(gè)細(xì)胞的基因信息則會(huì)被整體覆蓋。2009年首個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)問世，開啟了單細(xì)胞組學(xué)時(shí)代，在2013年單細(xì)胞測序技術(shù)被Nature Methods評(píng)為年度技術(shù)。單細(xì)胞測序技術(shù)經(jīng)過十余年發(fā)展，各類單細(xì)胞測序技術(shù)平臺(tái)也如雨后春筍般出現(xiàn)，極大地推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究，幫助科研人員克服了稀有生物樣本以及生物樣本內(nèi)生異質(zhì)性等重大挑戰(zhàn)。
DNBelab C4 基于液滴微流控原理，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的捕獲和標(biāo)記，使用DNBSEQ建庫技術(shù)構(gòu)建專有文庫，采用DNBSEQ T7系統(tǒng)獲得測序數(shù)據(jù)，并使用配套的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與可視化，在單細(xì)胞層面進(jìn)行基因表達(dá)、細(xì)胞注釋和異質(zhì)化研究。
1、測序策略
測序策略：PE100
測序深度：推薦平均50k reads/cell
測序數(shù)據(jù)量：100~120G/樣本
2、送樣建議
（1）細(xì)胞：大于1*106個(gè)細(xì)胞；
（2）組織解離的細(xì)胞：大于1*106個(gè)細(xì)胞；
（3）血液：大于3 mL；
（4）PBMC：大于1*106個(gè)細(xì)胞；
（5）組織：大于黃豆粒大??；
（6）細(xì)胞活性大于80%。
3、技術(shù)優(yōu)勢
（1）便攜，操作簡單：重量220g，無需電源，負(fù)壓驅(qū)動(dòng)的液滴生成系統(tǒng)，有效地簡化液滴捕獲過程。
（2）雙磁珠高效捕獲：采用自主設(shè)計(jì)的捕獲磁珠，有效提高細(xì)胞捕獲效率以及獲取下?lián)艿耐暾畔ⅰ?/span>
（3）低雙胞率，基因檢測能力更穩(wěn)定：雙胞率低于8%，每個(gè)細(xì)胞平均基因數(shù)在1000~2000。
（4）數(shù)據(jù)高保真，性價(jià)比高：搭配國產(chǎn)超高通量DNBseq-T7測序平臺(tái)，既保證測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，也降低測序成本。
4、數(shù)據(jù)分析
4.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估
a. 各個(gè)樣本測序數(shù)據(jù)基本質(zhì)控（reads數(shù)、測序飽和度等）
b. 各個(gè)樣本數(shù)據(jù)比對(duì)（細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)、reads基因組比對(duì)率等）
c. 多樣本數(shù)據(jù)合并（基因表達(dá)定量）
（2）單細(xì)胞亞群分類與分類結(jié)果可視化
a. 細(xì)胞過濾
b. 單細(xì)胞亞群分類（各亞群單個(gè)細(xì)胞基因中位數(shù)、各樣本在各亞群數(shù)目統(tǒng)計(jì)）
c. 分類結(jié)果可視化（聚類分析可視化（tSNE圖））
（3）亞群上調(diào)表達(dá)基因分析
a. 上調(diào)表達(dá)基因篩選
b. 上調(diào)表達(dá)基因基因GO功能富集分析
c. 上調(diào)表達(dá)基因KEGG功能富集分析
（4）標(biāo)記基因篩選
a. 標(biāo)記基因篩選（標(biāo)記基因在各亞群平均表達(dá)量、標(biāo)記基因聚類熱圖）
b. 各標(biāo)記基因在群體中的表達(dá)分布（標(biāo)記基因tSNE圖）
4.2 高級(jí)分析
（1）已知表達(dá)基因（分子markers或表面標(biāo)記物）在各亞群表達(dá)分布圖及熱圖（甲方提供基因標(biāo)準(zhǔn)名稱）
（2）細(xì)胞軌跡分析
（3）加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）
（4）差異表達(dá)基因TF編碼能力預(yù)測
（5）差異表達(dá)基因蛋白互作分析
（6）基因相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析
（7）細(xì)胞周期鑒定分析
5、技術(shù)流程
6、案例分析
案例（1） 非人靈長類動(dòng)物食蟹猴的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
研究團(tuán)隊(duì)對(duì)食蟹猴45個(gè)組織約114萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序分析，獲得非人靈長類動(dòng)物全身器官細(xì)胞圖譜（圖1）?；谠搱D譜構(gòu)建了126種病毒易感細(xì)胞類型的病毒數(shù)據(jù)庫，可以通過它快速查詢病毒最有可能侵染的細(xì)胞類型，同時(shí)看到該細(xì)胞類型可能分布的器官。該圖譜還可用于物種進(jìn)化、人類疾病以及藥物評(píng)價(jià)和篩選相關(guān)的研究，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供基礎(chǔ)性的資源和工具，為疾病診療、靶向藥物開發(fā)提供助力，為人類更好地探究生命的進(jìn)化提供可能。
圖1 食蟹猴全身器官圖譜
案例（2） 人類多能性干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為8細(xì)胞階段全能性胚胎樣細(xì)胞
研究團(tuán)隊(duì)通過系統(tǒng)性的篩選，首次建立了體外全能性的8細(xì)胞期胚胎樣細(xì)胞（8CLC）的誘導(dǎo)和富集方法。基于DNBelab C4平臺(tái)，對(duì)8CLC誘導(dǎo)過程的細(xì)胞樣本進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq）和染色質(zhì)可及性（scATAC-seq）測序，詳細(xì)分析了8CLC群體的特征，并在多個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)描繪了8CLC群體的特征，并在多個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)描繪了8CLC誘導(dǎo)過程中轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)開放性的動(dòng)態(tài)變化，為研究人類8細(xì)胞期的合子基因組激活和發(fā)育調(diào)控提供了重要的平臺(tái)和資源，將拓展我們對(duì)人類早期胚胎發(fā)育的有限認(rèn)知。
案例2 圖1 人胚胎干細(xì)胞圖譜
參考文獻(xiàn)：
[1]Han L，et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primateMacaca fascicularis[J]. Nature，2022
[2]Mazid, M.A., et al.Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage[J]. Nature，2022
