iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的兩種蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)。iTRAQ/TMT試劑由報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)三個基團(tuán)構(gòu)成。反應(yīng)基團(tuán)與肽段相連接使iTRAQ/TMT試劑結(jié)合在肽段上，在一級譜圖中，不同樣本的同一肽段，標(biāo)記后表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級譜圖中，報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，帶不同同位素標(biāo)簽的同一肽段產(chǎn)生質(zhì)量不同的報(bào)告離子，根據(jù)報(bào)告離子的豐度可獲得樣本間相同肽段的定量信息。
質(zhì)譜儀
FusionLumos、Q Exactive HF、Oribtrap、Q TOF 6600
技術(shù)優(yōu)勢
定量準(zhǔn)確：基于高效的鑒定軟件和嚴(yán)格的過濾條件，控制鑒定結(jié)果的可靠性
適用性廣：適用于所有物種的各類樣本
檢測通量高：一次可檢測8個樣本
蛋白數(shù)量多：能鑒定高達(dá)10000種蛋白
技術(shù)流程
實(shí)驗(yàn)流程
信息分析
生信分析總流程
標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）蛋白鑒定
（2）蛋白功能注釋
（3）蛋白亞細(xì)胞定位
（4）蛋白定量
（5）差異蛋白篩選
（6）蛋白互作
個性化分析
（1）蛋白組+轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
（2）其余個性化分析
分析結(jié)果示例
案例分析
案例（1）腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞來源的cadherin-2促進(jìn)血管生成，對肺腺癌有預(yù)后意義
本研究選取腺肺癌臨床組織分離的TECA（癌組織分離血管內(nèi)皮細(xì)胞）、PECA（癌旁組織分離血管內(nèi)皮細(xì)胞）及NECA（正常組織分離血管內(nèi)皮細(xì)胞）進(jìn)行iTRAQ蛋白組學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)血管蛋白Cadherin-2（CDH2）在肺癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)。通過結(jié)合過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和臨床樣本評估結(jié)果，確認(rèn)CDH2降解及表達(dá)的異質(zhì)性導(dǎo)致了與癌細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移/增殖相關(guān)的不同調(diào)控行為。研究為證實(shí)cadherin-2作為腺肺癌臨床診斷新的分子靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。
圖1 差異蛋白表達(dá)熱圖和不同樣本組蛋白數(shù)據(jù)的PCA分析
案例（2）WDR74通過RPL5-MDM2-p53通路調(diào)節(jié)黑素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移
本研究對小鼠黑色素瘤細(xì)胞株和黑色素瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞株進(jìn)行iTRAQ蛋白組學(xué)分析和qPCR、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了WDR74能促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞增殖，并通過過表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)等揭示了WDR74對RPL5-MDM2-p53通路的調(diào)控作用。WDR74及其機(jī)制的研究為WDR74作為臨床預(yù)防和治療黑素瘤的候選靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
圖2 通過iTRAQ檢測到WDR74的電離肽的注釋質(zhì)譜
圖3 WDR74調(diào)控RPL5-MDM2-p53通路機(jī)制圖
案例（3）利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)標(biāo)記揭示小鼠附睪脂肪組織中年齡和高脂飲食特異性蛋白質(zhì)組的變化
本研究主要從不同年齡的高脂與低脂小鼠中分離附睪脂肪組織，采用TMT標(biāo)記法探索年齡和高脂飲食對附睪組織中蛋白質(zhì)的變化。揭示出長期高脂飲食顯著改變了55種與免疫應(yīng)答和腎素-血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，確定了與年齡相關(guān)和高脂肪飲食特異性蛋白質(zhì)組學(xué)特征，突出了精氨酸代謝對年齡增長的響應(yīng)，以及支鏈氨基酸代謝對高脂肪喂養(yǎng)的早期響應(yīng)。
圖4 附睪脂肪蛋白質(zhì)組中飲食和年齡相關(guān)變化比較的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和工作流程
[1] Zhuo H, et, al. Tumor endothelial cell-derived cadherin-2 promotes angiogenesis and has prognostic significance for lung adenocarcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18:34.
[2] Li Y, et, al. WDR74 modulates melanoma tumorigenesis and metastasis through the RPL5-MDM2-p53 pathway[J]. Oncogene, 2020, 39: 2741-2755.
[3] Plubell D L, Wilmarth P A, Zhao Y , et al. Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2017, 16(5):873-890.
